Для разработки теоретической основы нейрональной антиоксидантной терапии окислительный стресс моделировали в культуре нейронов коры головного мозга in vitro и изучали репаративные механизмы, активированные в повреждённых нейронах через сигнальный путь PGC-1α/NRF1/NRF2/транскрипционный фактор А митохондрий (TFAM). Функции белков этого сигнального пути изучали с помощью программы STRING, анализирующей сетевые белок-белковые взаимодействия. Анализ ключевых генов сигнального пути PGC-1α/NRF1/NRF2/TFAM проводили с помощью программы Cytoscape. Нейроны in vitro инкубировали с H₂O₂ в концентрациях 25, 50, 75 и 100 мМ, после чего их жизнеспособность оценивали методом CCK8. В дальнейших экспериментах нейроны инкубировали с H₂O₂ в концентрации 75 мкМ, оказывающей максимальный повреждающий эффект, в течение 24, 48 или 72 ч. С помощью вестерн-блоттинга анализировали влияние окислительного стресса на экспрессию PGC-1a, NRF1, NRF2, ATP-5α и TFAM в нейронах. Уровень АФК в клетках, величину митохондриального мембранного потенциала, проницаемость митохондриальных пор и апоптоз нейронов оценивали методом проточной цитометрии. Анализ сети белок-белковых взаимодействий показал, что коактиватор транскрипции PGC-1α является ключевым регулятором энергетического метаболизма корковых нейронов, а NRF1 и NRF2 играют важную роль в биогенезе митохондрий и в ответе клеток на окислительный стресс. TFAM необходим для базальной транскрипции митохондриальной ДНК, причём его ген является концентратором сигнального пути PGC-1a/NRF1/NRF2. Вестерн-блоттинг и проточная цитометрия показали, что с развитием повреждений, вызванных окислительным стрессом, PGC-1a активировал экспрессию белков NRF1, NRF2 и TFAM, одновременно противодействуя снижению митохондриального мембранного потенциала и открыванию митохондриальных пор. При этом факторы NRF1 и NRF2 снижали уровень АФК и интенсивность апоптоза, а TFAM увеличивал экспрессию ATP-5a. Таким образом, при окислительном стрессе PGC-1a вызывает антиокислительные и противоапоптозные эффекты у повреждённых корковых нейронов путём активации сигнального пути NRF1/NRF2/TFAM.

To develop the theoretical basis for neuronal antioxidant therapy, the study employed in vitro model of oxidative stress of cortical neurons in order to examine the repair mechanisms triggered in the damaged neurons by PGC-1α/NRF1/NRF2/TFAM signal pathway. The functions of proteins in this signal pathway were examined with online STRING software, which analyzed the network of protein—protein interactions (PPI). The hub genes in PGC-1α/NRF1/NRF2/TFAM signal pathway were analyzed with Cytoscape software. In vitro, the cortical neurons were treated with 25, 50, 75, or 100 μl H₂O₂. The inhibition rate of neurons with various concentrations of H₂O₂ was assessed by CCK8, thereupon the neuronal cells were exposed to H₂O₂ in optimal concentration of 75 μM for 24, 48, or 72 h. The time-dependent changes in expression of PGC-1α, NRF1, NRF2, ATP-5α, and TFAM in neurons damaged by H₂O₂-induced oxidative stress was analyzed by Western blotting. The ROS level in damaged neurons, the value of mitochondrial membrane potential (MMP), permeability of mitochondrial membrane permeability transition pores (MPTP), and apoptosis of neurons were analyzed by flow cytometry. Analysis of PPI network showed that transcriptional coactivator PGC-1α is the key regulator of energy metabolism in the cortical neurons, while NRF1 and NRF2 play important roles in mitochondrial biogenesis and in the response to oxidative stress. TFAM is required for basal transcription of mitochondrial DNA, and it is a hub gene in PGC-1α/NRF1/NRF2 pathway. The Western blotting and flow cytometry showed that during the development of oxidative stress, PGC-1α augmented expression of NRF1, NRF2, and TFAM while simultaneously inhibiting MPP loss and mitigating MPTP opening. At this, NRF1/NRF2 diminished ROS level and reduced apoptosis, while TFAM enhanced expression of ATP-5α. Therefore, PGC-1α exerts the anti-oxidant and anti-apoptotic effects in cortical neurons exposed to oxidative stress via activation of NRF1/NRF2/TFAM signal pathway.