Генетика
Поиск и функциональный анализ генетических вариантов в сайтах связывания микроРНК с использованием массового параллельного репортерного анализа
Е.Ю.Рыкова1, Н.И.Ершов1, А.О.Дегтярева1, Л.О.Брызгалов1, Е.Л.Лушникова2 - 611-615
1ФГБНУ ФИЦ Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск, РФ; 2ФГБНУ ФИЦ ФТМ, Новосибирск, РФ
Проведён масштабный поиск генетических вариантов, обнаруживших различную представленность аллелей в транскриптомных данных (АЕ SNPs), в сайтах связывания микроРНК в 3'-НТО, а также оценка их функциональной значимости с использованием массового параллельного репортерного анализа (MPRA). Из 629 559 ассоциированных пар "SNP—ген" (eQTLs), найденных в ткани печени человека по данным консорциума GTEx Analysis v8, были выбраны 4394 полиморфные позиции в 3'-НТО генов, являющиеся eQTLs для этих же генов. Для поиска потенциальных сайтов связывания микроРНК использовали алгоритм TargetScanHuman 7.0 и ресурс PolymiRTS. Из предсказанных сайтов микроРНК, затрагиваемых eQTL-SNPs, был выбран 51 сайт с наилучшим свидетельством функциональности по экспериментальным данным Ago2-CLIP-seq, CLEAR-CLIP, eCLIP-seq для РНК-связывающих белков. Для анализа методом MPRA создана библиотека плазмид, содержащих для каждого AE SNРs основной и альтернативный аллели (102 конструкции). Трансфекция клеточной линии HepG2 полученной библиотекой плазмид и секвенирование целевых последовательностей ДНК и РНК на платформе Illumina (MiSeq) выявили асимметричную экспрессию для 6 SNРs.
Ключевые слова: однонуклеотидные замены; сайты связывания микроРНК; массовый параллельный репортерный анализ (MPRA)
Адрес для корреспонденции: rykova.elena.2014@gmail.com Рыкова Е.Ю.
DOI: 10.47056/0365-9615-2023-176-11-611-615
Search for and functional analysis of genetic variants in microRNA binding sites using massively parallel reporter assay
E. Yu. Rykova1, N. I. Ershov1, A. O. Degtyareva1, L. O. Bryzgalov1, and E. L. Lushnikova2
1Federal Research Center Institute of Cytology and Genetics, Siberian Division of the Russian Academy of Sciences, Novosibirsk, Russia; 2Federal Research Center of Fundamental and Translational Medicine, Novosibirsk, Russia
A large-scale search for the genetic variants with a bias in the representation of alleles in transcriptome data (AE SNPs) and the binding sites in microRNA 3'UTRs is performed and their functional significance is assessed using massively parallel reporter assay (MPRA). In total, 4394 polymorphic positions in the 3'UTRs of the genes, which represent the eQTLs for these, are selected of the 629 559 associated "SNP—gene" pairs (eQTLs) discovered in the human liver tissue according to the GTEx Analysis V8 data. The TargetScanHuman 7.0 algorithm and PolymiRTS database are searched for the potential microRNA binding sites. Of the predicted microRNA sites affected by eQTL-SNPs, we have selected 51 sites with the best evidence of functionality according to Ago2-CLIP-seq, CLEAR-CLIP, and eCLIP-seq for RNA-binding proteins. For MPRA, a library of the plasmids carrying the main and alternative alleles for each AE SNP (in total, 102 constructs) is created. Transfection of the HepG2 cell line with the constructed plasmid library and sequencing of target DNA and RNA sequences using the Illumina (MiSeq) platform have allowed us to detect an allele-specific expression for six SNPs.
Key Words: single nucleotide substitutions; microRNA binding sites; massively parallel reporter assay (MPRA)