Иммунология и микробиология
Выявление мутаций в гене pncA Mycobacterium tuberculosis c помощью модифицированного метода анализа кривых плавления продуктов ПЦР с высоким разрешением
М.Л.Филипенко1, М.А.Дымова1, А.Г.Чередниченко2, Е.А.Храпов1, О.В.Мишукова1, Я.Ш.Шварц2 - 220-226
1ФГБУН Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск, РФ; 2ФГБУ Новосибирский научно-исследовательский институт туберкулеза Минздрава России, Новосибирск
Разработаны протоколы и проведено сравнение эффективности выявления мутаций в гене pncA, ассоциированных с устойчивостью M. tuberculosis к пиразинамиду, методом анализа кривых плавления 7 перекрывающихся пар праймеров с искусственным формированием гетеродуплексов (H-HRM) за счет коамплификации ДНК дикого типа и тестируемой ДНК, а также классического HRM анализа. С помощью HRM и H-HRM была проанализирована ДНК 35 PZAR изолятов, несущих мутации в гене pncA, 3 PZAR изолятов без мутаций pncA, а также 20 PZAS изолятов без мутаций pncA. Чувствительность и специфичность HRM для выявления мутаций в гене pncA оказалась умеренной — 88.57% (доверительный интервал 73.26-96.80%) и 82.61% (61.22-95.05%) соответственно. Чувствительность H-HRM составила 97.14% (85.08-99.93%), специфичность — 95.65% (78.05-99.89%), со значительным улучшением точности — 96.55% против 93.85% при HRM. В целом, несмотря на добавление дополнительной стадии уравнивания концентраций тестовой и контрольной микобактериальной ДНК, H-HRM показал большую устойчивость и воспроизводимость при стандартных настройках математического обеспечения для обработки данных кривых плавления.
Ключевые слова: Mycobacterium tuberculosis, лекарственная устойчивость, мутации, пиразинамид, ген pncA
Адрес для корреспонденции: mlfilipenko@gmail.com Филипенко М.Л.
Modified high resolution melting analysis for Mycobacterium tuberculosispncA mutations testing
M. L. Filipenko1, M. A .Dymova1, A. G. Cherednichenko2, E. A. Khrapov1, O. V. Mishukova1, Ya. Sh. Shwartz2
1Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Siberian Division Russian Academy of Sciences, Novosibirsk, Russia; 2Novosibirsk Research Institute of Tuberculosis, Ministry of Health of the Russian Federation, Novosibirsk, Russia
In this paper, we developed protocol for detection of mutations in the pncA gene associated with the resistance of M.tuberculosis to pyrazinamide by analyzing the melting curves of 7 overlapping amplicons with artificial heteroduplex formation (H-HRM) formed by co-amplification of wild-type DNA and test DNA followed by comparison of its efficiency and robustness with classical HRM analysis. 35 PZAR DNA isolates carrying mutations in the pncA gene, 3 PZAR isolates without mutations in the pncA gene, and 20 PZAS isolates without mutations in the pncA gene were analyzed using HRM and H-HRM. The sensitivity and specificity of HRM for detection of mutations in the pncA gene was moderate - 88.57% (CI 73.26%-96.80%) and 82.61% (CI 61.22%-95.05%), respectively. The sensitivity of the H-HRM test was 97.14% (CI 85.08%-99.93%) and specificity 95.65% (CI 78.05%-99.89%), with a significant improvement in accuracy - 96.55% versus 93.85% for HRM. In general, despite the addition of equalizing the concentrations of test and control mycobacterial DNA, H-HRM showed greater stability and reproducibility at the standard settings of the melting curve analysis software.
Key Words: Key Words: Mycobacterium tuberculosis; drug resistance; mutations pyrazinamide; pncA gene