На модели 40-минутной ишемии почки с нефрэктомией контралатеральной почки сравнивали количественные и морфологические характеристики внеклеточных везикул мочи (ВВМ) интактных крыс и после ишемии/реперфузии (ИР) и оценивали их влияние на клетки почечного эпителия MDCK in vitro. ВВМ выделяли методом дифференциального ультрацентрифугирования, характеризовали с помощью иммуноблоттинга, NTA-анализа и измерения концентрации общего белка. Поглощение ВВМ клетками MDCK исследовали методом конфокальной микроскопии. Пролиферацию клеток в режиме реального времени оценивали на приборе iCELLigence RTCA в нормальных условиях, при кислородно-глюкозной депривации (КГД) и в период восстановления. Развитие острого почечного повреждения подтверждалось повышением креатинина и мочевины в сыворотке крови крыс, а также появлением NGAL и β-актина в моче. Концентрация белка и количество частиц во фракции ВВМ снижались после ИР, при этом средний размер частиц не изменялся. При инкубации меченых ВВМ с клетками MDCK частицы выявлялись внутри клеток уже в первые часы, а через 24 ч частично колокализовались с лизосомами. Интактные ВВМ в концентрации 20 и 40 мкг/мл снижали пролиферацию клеток MDCK в фазе восстановления после КГД, при этом ВВМ после ИР снижали этот показатель в концентрации 20 мкг/мл, но не 40 мкг/мл. Малые ВВМ, продуцируемые после ИР почки, отличаются по количественным характеристикам и функциональным свойствам от ВВМ интактных животных, что может отражать изменение состояния повреждённого эпителия и указывает на способность ВВМ модулировать восстановление клеток in vitro.

We compared the quantitative and morphological characteristics of urinary extracellular vesicles (uEVs) from intact rats and rats subjected to renal ischemia/reperfusion (I/R), and assessed their effects on renal epithelial cells in vitro. A rat model of 40-min renal ischemia combined with contralateral nephrectomy was used. uEVs were isolated by differential ultracentrifugation and characterized by immunoblotting, nanoparticle tracking analysis (NTA), and measurement of total protein concentration. The uptake of uEVs by MDCK cells was examined by confocal microscopy. Cell index in MDCK culture with added uEV from intact rats or rats after I/R was monitored in real time using the iCELLigence RTCA system under normal conditions, during oxygen-glucose deprivation (OGD), and during the recovery period. The development of acute kidney injury was confirmed by increased serum creatinine and urea levels in rats after I/R, as well as by the appearance of NGAL and β-actin in urine. After I/R, both the total protein concentration and particle number in the uEV fraction were reduced, whereas the mean particle size remained unchanged. Upon incubation of labeled uEVs with MDCK cells, particles were detected inside the cells within the first few hours and partially colocalized with endolysosomes after 24 h. uEVs obtained from intact rats at concentrations of 20 and 40 μg/mL reduced MDCK cell proliferation during the recovery phase after OGD. uEVs from rats after I/R reduced this parameter at 20 μg/mL, but not at 40 μg/mL. Small uEVs isolated after renal I/R injury differ in their quantitative characteristics and functional properties from vesicles isolated from intact animals. These changes may reflect pathological alterations in the injured tubular epithelium and indicate the potential of uEVs to modulate cellular recovery in vitro.